Oleh sebab Justinianus bukan ketua rasmi mana-mana mazhab gereja Kristian, beliau menumpukan dirinya untuk mengurangkan dan, jika boleh, menghapuskan perselisihan antara mazhab dan di dalam empayarnya. Beliau percaya bahawa sebagai maharaja Kristian, beliau patut cuba bekerjasama dengan imam-imam mazhab. Selain itu, memandangkan Justinianus mengikut ajaran Khalsedon dan Theodora mengikut kepercayaan Miafisitsme, Justinianus berusaha untuk menyatukan semula gereja Konstantaniah dan Rom yang telah berpecah. Beliau inginkan menyatukan gereja untuk berganding tangan dengan Maharaja yang satu (dirinya). Maharaja akan menguruskan hal ehwal manusia manakala gereja akan menguruskan hal ehwal agama. Untuk memastikan kuasa dan autoritinya, Justinianus memastikan undang-undang mengakui bahawa beliau ialah manifestasi undang-undang dan telah diberi kuasa tertinggi oleh Tuhan. Beliau menggunakan undang-undang untuk mengawal bagaimana agama diamalkan, dengan membuat undang-undang yang khas untuknya.[36]

Theodora menentang suaminya menyokong Khalsedon dalam perselisihan mazhab ini.[37] Akibatnya, dia dituduh menyokong ajaran sesat dan menjejaskan perpaduan orang Kristian. Walau bagaimanapun, Prokopius dan Evagrios Skholastikos berpendapat bahawa Justinianus dan Theodora hanya berpura-pura berselisih dengan satu sama lain.

Walaupun Justinianus bermazhab Khalsedon, Theodora membina sebuah biara Miafisitisme di Sykae dan memberi perlindungan di istana untuk imam-imam Miafisitisme yang ditentang oleh kebanyakan orang Kristian Khalsedon, seperti Severus dan Anthimus. Anthimus telah dilantik sebagai Penatua Konstantaniah kerana pengaruh Theodora, dan selepas dikucilkan beliau disembunyikan di kediaman Theodora selama 12 tahun sehingga Theodora mangkat. Apabila Efraim, seorang penatua mazhab Khalsedon, mencetuskan pemberontakan yang ganas di Antokiah, lapan orang uskup Miafisitisme dijemput ke Konstantaniah dan Theodora menempatkan mereka di Istana Hormisdas yang bersambung dengan Istana Besar. Ia pernah didiami Justinianus dan Theodora sebelum mereka menjadi maharaja dan maharani.

Di Mesir, apabila Paus Timotius III meninggal dunia, Theodora meminta bantuan daripada Dioskoros, pegawai pentadbir diraja, dan Aristomakhos, pembesar Mesir, untuk menjadikan salah seorang pengikut Severus bernama Theodosius penggantinya. Dengan melakukan hal ini, Theodora mengakali suaminya yang inginkan seorang pengikut Khalsedon ambil alih. Paus Theodosius I dari Iskandariah, walaupun dengan bantuan tentera maharaja, gagal bertahan di Iskandariah kerana ditentang pengikut Khalsedon Justinianus. Beliau kemudian dibuang negeri oleh Justinianus, bersama-sama dengan 300 penganut Miafisitisme ke kota Delkos di Thrake.

Apabila Paus Silverius menolak permintaan Theodora agar kutukan Paus Agapetus I daripada Paus Antimos dibuangkan, Theodora menghantar arahan kepada Belisarius untuk memikirkan cara untuk singkirkan Silverius. Setelah berjaya, Paus Vigilius dilantik sebagai penggantinya.

Di Nobatia, selatan Mesir, penduduknya diajak memeluk mazhab Miafisitisme sekitar tahun 540. Justinianus mahu mereka mengikuti kepercayaan Khalsedon manakala Theodora mahu mereka menjadi pengikut Miafisitisme. Justinianus mengarahkan mubaligh-mubaligh Khalsedon dari Thebais untuk membawa hadiah dan melawat Silko, raja Nobatia. Apabila Theodora mendengar tentang ini, dia juga menghantar kumpulan mubalighnya sendiri dan meminta Pembesar Thebais untuk melambatkan mubaligh-mubaligh Justinianus supaya mubaligh dia tiba dahulu. Pembesar yang bijak itu menjalankan permintaan Theodora dan menangguh mubaligh Khalsedon. Apabila mereka akhirnya menghadap Silko, mereka disuruh pergi kerana Nobatia telah memeluk Miafisitisme.